实验原理

　　细菌和其它生物一样，大多数属异养菌，必须从周围环境中摄取营养，进行新陈代谢及生长繁殖等生命活动。人为的提供细菌生长繁殖所需的营养物质（适宜的培养基）和创造适合细菌生长繁殖的有利条件如温度、湿度、气体等，能使细菌在体外迅速生长繁殖。

细菌生长繁殖的条件：1充足的营养物质2适宜的温度3合适的酸碱度（pH）4必要的气体环境

培养基配制

正确配制培养基是微生物培养的基础步骤之一，实验室使用各种基础成分制备培养基时，应按照配方准确配制，并记录相关信息，如：培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积（分装体积）、无菌措施（包括实施的方式、温度及时间）、配置日期、人员等，以便溯源。

常见的灭菌方法有：1化学物质灭菌：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性、酶失活；使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌；常用的有酒精、来苏尔等。

2辐射灭菌：原理是利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡；常用的有紫外线、X射线和γ射线，用于室内空气及器皿表面灭菌。

3干热灭菌：原理是利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物；常用灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时，适于对玻璃及金属用具及沙土管灭菌。

4湿热灭菌：原理是直接用蒸汽灭菌，蒸汽在冷凝时能释放出大量潜热，蒸汽具有强大的穿透力，破坏菌体蛋白和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡，水煮常压灭菌：100℃，或饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟，适合培养基和发酵设备灭菌。

5过滤除菌：除菌原理是利用微生物不能透过滤膜除菌，方法是使用0.01~0.45 μm孔径滤膜，用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

接种方法

将微生物接到适于他生长的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种，接种方法有以下几种：1划线接种：最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用，常用的接种工具有接种环、接种针等，在斜面接种和平板接种中常用此法

2三点接种：在研究霉菌形态时常用此法，即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态

3穿刺接种：在保藏厌氧菌或研究微生物的动力时常采用此法，做穿刺接种时，用的接种工具是接种针，用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底做支线穿刺

4浇混接种：将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的；待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落

5涂布接种：与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落

6液体接种：从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种

7注射接种：该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病

8活体接种：活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖，所用的活体可以是整个动物、某个离体活组织、发育的鸡胚，接种的方式是注射、拌料喂养等

微生物保藏

根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度， 使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率；低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。菌种保藏步骤：1挑选特征典型的纯菌菌落2确定保藏的合适菌体形态3选择最适宜的保藏方法4定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法；保藏期满 应及时进行移种

菌种保藏方法：1琼脂斜面低温保存法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸包好，放在4℃左右的冰箱中保藏，每隔2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年～一年，有的甚至更长时间。2液体石蜡保存法：将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。取液体石蜡装在试管中，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~ 170 ℃烤箱中1 ~ 2 h或干燥器内除去液体石蜡中的水分，将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端 1cm为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。